廢棄液（Bleed）循環(huán)是一種通過濃縮工藝廢棄液、以選擇性去除生物質(zhì)并循環(huán)液體部分，來提高穩(wěn)態(tài)灌流工藝產(chǎn)量的新方法。這導(dǎo)致顯著的產(chǎn)品節(jié)省，后者否則將被浪費(fèi)。只要能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行濃縮分離，現(xiàn)有的細(xì)胞分離裝置都可以用于此類應(yīng)用。然而，比較廢棄液循環(huán)應(yīng)用的操作模式和效率的信息有限。傾斜重力沉降首次被用作廢棄液循環(huán)技術(shù)，并與聲學(xué)分離進(jìn)行了比較。除了較低的碎片去除率外，傾斜重力沉降顯示出相似的廢棄液循環(huán)效率，并且對(duì)細(xì)胞活性、營養(yǎng)和代謝物水平以及產(chǎn)品質(zhì)量沒有負(fù)面影響。此外，考慮到降低系統(tǒng)復(fù)雜性以及便于規(guī)模放大，傾斜重力沉降是在 42 天實(shí)驗(yàn)室規(guī)模灌流工藝中進(jìn)一步評(píng)估的首選技術(shù)。實(shí)現(xiàn)了高達(dá) 3.5 倍的廢棄減低以及 19% 的平均收獲率提升。隨后使用適用于 2,000 L 灌流工藝的大型傾斜重力沉降器測試了可放大性，以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)的性能。來自篩選實(shí)驗(yàn)的廢棄液循環(huán)特征數(shù)據(jù)與可放大性論證相結(jié)合，有助于在考慮新灌流工藝設(shè)置的廢棄液循環(huán)以減少灌流浪費(fèi)、提高工藝可持續(xù)性和提高整體工藝產(chǎn)量時(shí)做出決策。
廢棄液循環(huán)是一項(xiàng)通過減少廢物流（工藝廢棄液）來最大化穩(wěn)態(tài)灌流產(chǎn)量的新技術(shù)。因此，將聲學(xué)分離與傾斜重力沉降進(jìn)行比較，以評(píng)估它們?cè)诟鞣N工藝條件下進(jìn)行連續(xù)廢棄液循環(huán)操作的適用性。兩種技術(shù)均未觀察到對(duì)工藝代謝物和產(chǎn)品質(zhì)量的影響，同時(shí)顯著提高了工藝產(chǎn)量。隨后擴(kuò)大 2,000 L 灌流工藝，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
最近關(guān)于灌流細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道顯示其單位體積生產(chǎn)率增加、產(chǎn)品質(zhì)量更均勻，以及由于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)在生物反應(yīng)器中的產(chǎn)品停留時(shí)間減少而帶來的好處。單克隆抗體的連續(xù)生產(chǎn)包括穩(wěn)態(tài)灌流細(xì)胞培養(yǎng)過程，隨后是連續(xù)捕獲步驟和多個(gè)精純步驟。為了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)灌流操作，不僅需要用于無細(xì)胞收獲的細(xì)胞截留裝置 (CRD)，還需要用于去除過多生物質(zhì)的廢物流（廢棄液，Bleeding）。廢棄不是選擇性操作，因?yàn)閺U棄與生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)物具有相同的成分。假設(shè)工藝活細(xì)胞體積 (VCV) 為10%，意味著 10% 生物質(zhì)和 90% 液體部分的廢棄組合物。由于在穩(wěn)定的灌流工藝中需要通過廢棄操作來維持目標(biāo)細(xì)胞密度，這會(huì)導(dǎo)致大量液體（含有目的產(chǎn)品）與過多的生物質(zhì)一起被浪費(fèi)。
在計(jì)算灌流工藝的產(chǎn)量時(shí)，必須考慮產(chǎn)物濃度（收獲滴度）和收獲率。因此，過高的廢棄率在工藝強(qiáng)化方面是不受歡迎的，因?yàn)樗鼈儠?huì)導(dǎo)致收獲率降低。盡管行業(yè)內(nèi)收獲滴度有了重大改進(jìn)，但很少有人關(guān)注灌流廢棄液率的降低。
提高工藝產(chǎn)量的第一個(gè)策略包括降低整體工藝廢棄率。文獻(xiàn)報(bào)道了細(xì)胞周期抑制劑或溫度變化對(duì)生長的抑制。盡管提高了工藝產(chǎn)量，但生長抑制會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變化。此外，廢棄率對(duì)應(yīng)于細(xì)胞分裂率。雖然低細(xì)胞分裂率最初可能會(huì)提高工藝產(chǎn)量，但這種方法可能會(huì)危及細(xì)胞培養(yǎng)的長期高活性和穩(wěn)定性。
第二種策略是濃縮廢棄液流、以減少伴隨廢棄液流中的生物質(zhì)而被浪費(fèi)的液體部分。只有濃縮的生物質(zhì)被直接處理成廢物，澄清的液體被引導(dǎo)回生物反應(yīng)器，從而提高灌流收獲率和工藝產(chǎn)量。來自生物反應(yīng)器的廢棄流對(duì)應(yīng)于細(xì)胞分裂率，在這種情況下沒有減少，但其中很大一部分液體被循環(huán)回生物反應(yīng)器。因此，最近進(jìn)行了一項(xiàng)概念驗(yàn)證研究，該研究使用聲學(xué)分離器實(shí)施固液分離步驟，以濃縮灌流工藝廢棄流中的生物質(zhì)，并將其指定為廢棄循環(huán)。在 5% 的 VCV 下，在 2 L 規(guī)模下測試了 4 天的時(shí)間，檢測到良好的分離效率，并且產(chǎn)品質(zhì)量或代謝物概況沒有變化。液體-固體分離裝置，而不是生長抑制，可以通過在不降低培養(yǎng)性能的情況下保持足夠高的廢棄率，從而降低長期工藝穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)。Bielser 等人的研究是文獻(xiàn)中關(guān)于廢棄液循環(huán)的第一份報(bào)告，需要進(jìn)一步研究，以探索其在較高 VCV 和不同灌流工藝條件下的潛在益處。此外，尚未證明用于廢棄液循環(huán)的聲學(xué)分離的可放大性。
聲學(xué)分離器使用聲學(xué)共振場，使個(gè)體細(xì)胞聚集在一起，并形成更大的細(xì)胞聚集體。這些細(xì)胞聚集體由于尺寸較大而顯示出增強(qiáng)的沉降特性，并且一旦聲波中斷，就會(huì)更快地沉降。雖然在小規(guī)模操作中使用聲學(xué)沉降器作為 CRD 可以獲得非常有前途的分離結(jié)果，但關(guān)于聲學(xué)分離器的大規(guī)模應(yīng)用的信息有限。聲學(xué)分離器已成功測試用于澄清體積高達(dá) 200 L/day，并建議通過合并多個(gè)較小的聲學(xué)室進(jìn)一步擴(kuò)大規(guī)模。開發(fā)更大規(guī)模的聲學(xué)分離器似乎非常困難，因?yàn)榧?xì)胞分離需要大量的功率輸入，導(dǎo)致設(shè)備內(nèi)產(chǎn)生熱量。多室系統(tǒng)可能會(huì)解決散熱問題，但會(huì)大大增加系統(tǒng)的復(fù)雜性，因此需要探索更多技術(shù)作為廢棄液循環(huán)的替代方案。這些技術(shù)應(yīng)該不那么復(fù)雜，更容易放大，但表現(xiàn)出相似的性能特征。
除了聲學(xué)分離，傾斜重力沉降已成功用作 CRD 以維持穩(wěn)定的灌流過程。與聲學(xué)分離器相比，傾斜重力沉降器被廣泛研究并用于大規(guī)模生產(chǎn)生物反應(yīng)器，因?yàn)樗鼈兊膹?fù)雜性相對(duì)較低，且具有良好的可放大性，使它們成為用于廢棄液循環(huán)的聲學(xué)分離的有趣替代方案。當(dāng)顆粒（在本例中為細(xì)胞）在傾斜通道內(nèi)沉降時(shí)，在通道底部形成更高密度的漿液。在重力的驅(qū)動(dòng)下，漿液從表面滑落，產(chǎn)生增強(qiáng)沉降過程的對(duì)流，被稱為“Boycott 效應(yīng)”。由于沒有聲學(xué)共振場的聚集支持，傾斜重力沉降器往往比聲學(xué)分離器大。這伴隨著傾斜重力沉降器內(nèi)培養(yǎng)物停留時(shí)間的增加，在用于廢棄液循環(huán)時(shí)，對(duì)培養(yǎng)性能的影響未知。
由于沉降技術(shù)不能保證 100% 澄清的培養(yǎng)收獲，這導(dǎo)致廣泛使用基于過濾器的細(xì)胞截留裝置，主要使用基于中空纖維組件的切向流過濾 (TFF) 和交替式切向流 (ATF) 技術(shù)，廢棄液循環(huán)的工藝要求不同。在廢棄液循環(huán)的情況下，循環(huán)裝置的主要目的是盡可能多地濃縮細(xì)胞而不是提供完整的無細(xì)胞收獲流。澄清的循環(huán)液流，即使含有一些剩余的細(xì)胞，也將被引導(dǎo)回生物反應(yīng)器并最終增加收獲流。用于進(jìn)一步下游工藝操作的過濾由主細(xì)胞截留裝置執(zhí)行，而不是由廢棄液循環(huán)裝置執(zhí)行。由于不僅整個(gè)細(xì)胞而且更小的顆粒（如細(xì)胞碎片）都可以循環(huán)到生物反應(yīng)器中，因此應(yīng)研究細(xì)胞碎片對(duì)細(xì)胞截留過濾器污染的可能負(fù)面影響。定義關(guān)鍵工藝碎片水平和與過濾器污染的相應(yīng)相關(guān)性尚未得到證實(shí)，并且很可能會(huì)根據(jù)所選的工藝參數(shù)、設(shè)備和操作模式而變化。
本研究的目的是證實(shí)廢棄液循環(huán)在工業(yè)相關(guān)灌流工藝強(qiáng)化中的應(yīng)用。傾斜重力沉降首次用作廢棄液循環(huán)裝置，并在廢棄液循環(huán)效率、代謝物概況、產(chǎn)品質(zhì)量屬性、細(xì)胞碎片去除和操作簡便性方面與聲學(xué)分離進(jìn)行了比較。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模研究了涵蓋工藝 VCV、工藝廢棄率和沉降器操作參數(shù)的各種灌流方案，以量化通過廢棄液循環(huán)對(duì)各種情況進(jìn)行工藝強(qiáng)化的潛力。通過建造一個(gè)大型傾斜重力沉降器和循環(huán) 2000 L 灌流生物反應(yīng)器廢棄流，證明了廢棄循環(huán)的可放大性。報(bào)告了成功結(jié)果的詳細(xì)信息，重點(diǎn)關(guān)注了廢棄液循環(huán)技術(shù)的性能，更重要的是，還關(guān)注了廢棄液循環(huán)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)性能和產(chǎn)品質(zhì)量的影響。
詳細(xì)試驗(yàn)操作和結(jié)果，請(qǐng)參考原文。
中試規(guī)模灌流細(xì)胞培養(yǎng)
一種生產(chǎn)雙特異性單克隆抗體 (mAb2) 的專有 CHO-K1 細(xì)胞系在 200 L 灌流生物反應(yīng)器（Mobius 200 L 生物反應(yīng)器，Merck KGaA）中培養(yǎng)。VCV 使用在線電容探針（Incyte Arc，Hamilton）保持恒定在 8%。使用孔徑為 0.22 μm 的聚醚砜中空纖維（Repligen）截留細(xì)胞。生產(chǎn)完成后，剩余的細(xì)胞培養(yǎng)液用于測試大型傾斜重力沉降器（Constructions Inoxydables SA），其流量適應(yīng) 2000 L 灌流生物反應(yīng)器。在實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)液攪拌并保持在 35°C。使用 CO2 或 1.1 M Na2CO3 將 pH 控制在 6.95 ± 0.15（InPro3253i，Mettler Toledo），并將 DO 保持在 50%（InPro6860i/12/120/nA，Mettler Toledo）。停止灌流和電容控制。
大規(guī)模灌流細(xì)胞培養(yǎng)
將 2000 L 生物反應(yīng)器（Mobius 2000 L 生物反應(yīng)器，Merck KGaA）以活細(xì)胞密度 0.67 × 10^6 cells/mL（mAb1）進(jìn)行接種，恒定填充體積為 1,500 L。使用 CO2 或 1.1 M Na2CO3 將pH 控制在 6.95 ± 0.15（InPro3253i，Mettler Toledo)，DO 維持在 50% (InPro6860i/12/120/nA, Mettler Toledo)。在生長階段，溫度保持在 36.5 °C，一旦達(dá)到電容設(shè)定點(diǎn)，溫度調(diào)整至 33 °C。VCV 使用在線電容探針（Incyte Arc）保持恒定在 8%。流量計(jì)（LFS-03SU-Z-SC1-G25，Levitronix）用于工藝廢棄管線，以監(jiān)測流量并從總體目標(biāo)收獲率中扣除該量。灌流率在生長期逐漸增加，直到 1.3 RV/day，自此保持恒定到運(yùn)行結(jié)束。通過兩個(gè)并聯(lián)的一次性交替式切向流裝置（XCell ATF? 10，Repligen）和孔徑為 0.22 μm 的聚醚砜中空纖維截留細(xì)胞。在每個(gè) ATF10 上通過流量計(jì)控制收獲流速，并通過重量計(jì)算，控制新鮮培養(yǎng)基的添加，以保持生物反應(yīng)器恒定。
大規(guī)模傾斜重力沉降器運(yùn)行
為了進(jìn)行性能評(píng)估，將傾斜重力沉降器（圖 1D）連接到 200L 生物反應(yīng)器。帶有流量計(jì)的泵（LFS-03SU-Z-SC1-G25，Levitronix）用于控制重力沉降器的入口流速。校準(zhǔn)泵（Serie 520 U, Watson-Marlow）被放置在重力沉降器的底部出口，以確保濃縮的細(xì)胞不會(huì)返回沉降器。頂部的出口流量由第二個(gè)流量計(jì)監(jiān)測。通過將 200L 培養(yǎng)體積加載到傾斜重力沉降器，以與 2000L 生物反應(yīng)器填充體積、1.3 VVD 灌注率和 18%（470L/day）、23% (600L/day) 和 28% (730L/day) 的廢棄率相匹配的操作速度來評(píng)估大型重力沉降器的性能。同時(shí)，沉降器回收率達(dá)到 75% 的目標(biāo)。
對(duì)于大規(guī)模評(píng)估，傾斜重力沉降器連接在 2000L 生物反應(yīng)器的廢棄管線上，在控制狀態(tài)下填充體積為 1500L。入口流量（廢棄流）由電容探針調(diào)節(jié)。澄清的回收（重力沉降器頂部）和濃縮廢物（設(shè)備底部）連接到兩個(gè)獨(dú)立的罐中。由于存在不同于 2L 灌流運(yùn)行的另一個(gè)控制系統(tǒng)，因此必須更改控制策略。不是根據(jù)工藝廢棄流來調(diào)整流速，而是將沉淀器上濃縮廢物的固定泵速設(shè)置為達(dá)到大約 70% 的循環(huán)率。基于 430L/day的平均過程廢棄量，濃縮廢棄泵設(shè)置為 130L/day。為了穩(wěn)定工藝廢棄流，工藝廢棄流的上限設(shè)置為 450L/day。
圖 1. 廢棄液循環(huán)設(shè)置 (A)、實(shí)驗(yàn)室規(guī)模聲學(xué)沉降器 (B)、實(shí)驗(yàn)室規(guī)模傾斜重力沉降器 (C) 和大型傾斜重力沉降器 (D) 的示意圖。
圖 6. 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模 2 L 灌流沉降器運(yùn)行的過程數(shù)據(jù)與 mAb1 沒有廢棄循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)控制運(yùn)行的比較。VCV 和活性 (A)、葡萄糖和乳酸濃度 (B)、理論循環(huán)率設(shè)定點(diǎn) (C)、氨和 pH 曲線 (D)、工藝收獲率 (E)、收獲滴度和碎片趨勢 (F)、累積收獲量(G) 和累積工藝產(chǎn)量 (H)。灰色區(qū)域表示執(zhí)行了廢棄循環(huán)的工藝階段，而在白色工藝階段關(guān)閉了廢棄循環(huán)。
圖 8. 針對(duì)各種工藝廢棄率和循環(huán)率的離線大規(guī)模 2000L 灌流工藝沉降器評(píng)估，顯示入口和循環(huán)流的 VCV (A)、分離效率 (B)、細(xì)胞活性 (C) 和工藝產(chǎn)量增加 (D)。連接到 2000L 灌流運(yùn)行的傾斜重力沉降器流速的在線實(shí)時(shí)數(shù)據(jù) (E)。
總結(jié)和展望
本研究首次將傾斜重力沉降用于穩(wěn)態(tài)灌流過程中的廢棄液循環(huán)應(yīng)用，并將其與之前使用的聲學(xué)分離技術(shù)進(jìn)行了比較。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)中，聲學(xué)分離和傾斜重力沉降顯示出相似的廢棄液循環(huán)效率，并且對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物以及產(chǎn)品質(zhì)量沒有影響。僅用于去除細(xì)胞碎片，聲學(xué)沉降器在去除較小顆粒方面表現(xiàn)出卓越的性能。
出于簡化規(guī)模放大、降低系統(tǒng)復(fù)雜性的原因，傾斜重力沉降是長期穩(wěn)態(tài)灌流廢棄液循環(huán)所選擇的技術(shù)。它在 42 天的灌流細(xì)胞培養(yǎng)過程中，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下進(jìn)行了測試，然后放大到 2000L 灌流工藝。盡管廢棄率存在波動(dòng)，但開發(fā)并測試了自適應(yīng)自動(dòng)化策略，以在最佳設(shè)定點(diǎn)成功運(yùn)行沉降裝置。
對(duì)于 VCV 設(shè)置點(diǎn)為 12% 且廢棄率在 20% 和 25% 之間的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的灌流工藝，廢物液流最多可減少 3.5 倍，有效廢棄率降至 6%，從而提高收獲率19%。大型傾斜重力沉降器連接2000L灌流生物反應(yīng)器，灌流體積為1500 L/day，平均廢棄流430 L/day，循環(huán)率為70%，持續(xù)保持分離效率高于99%。甚至更高的 600 L/day時(shí)，廢棄流也可被成功濃縮，分離效率超過 94%，這代表灌流運(yùn)行具有 2000 L 灌流體積以及 23% 廢棄率。據(jù)作者所知，這是第一次使用傾斜重力沉降器在生產(chǎn)規(guī)模上進(jìn)行廢棄液循環(huán)。在兩種規(guī)模上都沒有觀察到對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響。
在考慮使用該技術(shù)提高現(xiàn)有或新灌流工藝的工藝產(chǎn)量時(shí)，在廢棄液循環(huán)方面獲得的見解為決策提供了合理支持的基礎(chǔ)，這些灌流工藝具有特定的目標(biāo)工藝 VCV、灌流速率和工藝廢棄速率。同樣，這些知識(shí)可以應(yīng)用于其它用于廢棄液循環(huán)的新興技術(shù)，例如連續(xù)流離心機(jī)，只要它們具有合適的尺寸，并允許在灌流細(xì)胞培養(yǎng)過程的整個(gè)運(yùn)行期間穩(wěn)定運(yùn)行。
