工藝和質(zhì)粒設(shè)計(jì)優(yōu)化、一次性設(shè)備和靈活的平臺(tái)工藝都發(fā)揮著重要作用。
隨著大量信使 RNA (mRNA) 疫苗和基于病毒載體的療法通過(guò)臨床試驗(yàn)取得批準(zhǔn)和商業(yè)化，對(duì)質(zhì)粒的需求正在急劇上升。上游生產(chǎn)工藝是將質(zhì)粒 DNA (pDNA) 材料推向市場(chǎng)的重要組成部分，因?yàn)樵诖笠?guī)模條件下實(shí)現(xiàn)最高產(chǎn)量對(duì)于滿足未來(lái)需求至關(guān)重要。預(yù)計(jì)發(fā)酵將成為大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量 pDNA 產(chǎn)品的主要方法。
上游質(zhì)粒生產(chǎn)：發(fā)酵、收獲和裂解
對(duì)于通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)的傳統(tǒng)生物制品，上游操作與發(fā)酵和收獲有關(guān)。然而，根據(jù) Catalent Cell & Gene Therapy 的 pDNA 工藝和分析開(kāi)發(fā)負(fù)責(zé)人 Nuria Gomez Santos 的說(shuō)法，對(duì)于質(zhì)粒生物生產(chǎn)，將細(xì)胞裂解和澄清作為上游工藝的一部分也很常見(jiàn)。 “根據(jù)這些工藝單元操作中細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞碎片的存在（上游）和不存在（下游）來(lái)確定截止點(diǎn)，”她解釋說(shuō)。 Catalent 使用 0.2 μm過(guò)濾步驟應(yīng)用這種截?cái)?，以進(jìn)一步分離上游和下游操作。
AGC Biologics 的 pDNA 和 mRNA 首席工藝開(kāi)發(fā)經(jīng)理 Karl Varadi 說(shuō)，一些公司將收獲的生物質(zhì)的重懸、隨后的堿裂解、澄清和濃縮/洗濾視為中游工藝 (MSP)，包括捕獲、精純和其它相關(guān)純化、配制和灌裝/完成步驟是下游工藝的一部分。鑒于裂解、中和和澄清在 pDNA 生產(chǎn)中的重要性，突破性藥物中心核酸和質(zhì)粒操作高級(jí)主管 John Bowen 同意這些步驟應(yīng)該作為中游單元操作單獨(dú)考慮。
R&D、GMP-like 和 GMP 質(zhì)粒不影響上游操作
對(duì)藥品生產(chǎn)商采取基于風(fēng)險(xiǎn)的生產(chǎn)方法的期望引起了人們對(duì)藥品生產(chǎn)中使用的關(guān)鍵材料所采用的生產(chǎn)實(shí)踐的關(guān)注，即使它們不會(huì)出現(xiàn)在最終藥品中。此類(lèi)輔助材料包括用作模板的質(zhì)粒 DNA，用于生產(chǎn) mRNA 和用作遞送基因載荷的病毒載體?？偟膩?lái)說(shuō)，該行業(yè)正朝著使用最高質(zhì)量的材料進(jìn)行臨床和商業(yè)化生產(chǎn)的方向發(fā)展，不僅是關(guān)鍵原材料，還有輔助材料。大多數(shù) pDNA 生產(chǎn)商因此提供三種不同的產(chǎn)品等級(jí)以供不同階段使用：R&D、GMP-like和cGMP。
“不同的質(zhì)量等級(jí)針對(duì)不同的應(yīng)用，”P(pán)lasmidFactory 首席執(zhí)行官 Martin Schleef 表示。 “對(duì)于新型治療基因候選產(chǎn)品或基因遞送策略的最初測(cè)試，R&D級(jí)質(zhì)粒就足夠了。研究過(guò)程的進(jìn)一步完善導(dǎo)致臨床和商業(yè)應(yīng)用的GMP-like中間級(jí)和最高 GMP 等級(jí)，”他觀察到。
用于 mRNA 和病毒載體生產(chǎn)的質(zhì)?？梢允侵虚g級(jí)或 GMP 級(jí)，這取決于藥物生產(chǎn)商的偏好。 PlasmidFactory 的項(xiàng)目經(jīng)理 Marco Schmeer 表示，用于直接臨床應(yīng)用的質(zhì)粒，例如 DNA 疫苗，必須是 GMP 級(jí)的。
“更高質(zhì)量的等級(jí)，”Schleef 說(shuō)，“通常是在專(zhuān)門(mén)的生產(chǎn)空間生產(chǎn)的，作為主動(dòng)質(zhì)量管理系統(tǒng)的一部分進(jìn)行更廣泛的質(zhì)量控制檢測(cè)，并有更多的文件包?！?/span>
然而，根據(jù) Santos 的說(shuō)法，質(zhì)量等級(jí)對(duì)上游和下游工藝操作沒(méi)有重大影響，因?yàn)閳?zhí)行相同的平臺(tái)工藝來(lái)生成R&D、GMP-like和 GMP 級(jí)質(zhì)粒。事實(shí)上，如果上游工藝從一開(kāi)始就考慮到生產(chǎn)因素，那么就不會(huì)對(duì)工藝開(kāi)發(fā)產(chǎn)生影響，Varadi 對(duì)此表示贊同。 “理想情況下，定義明確的上游工藝是通過(guò)縮小現(xiàn)有 GMP 生產(chǎn)基礎(chǔ)設(shè)施的規(guī)模來(lái)啟動(dòng)和設(shè)計(jì)的，以彌補(bǔ)技術(shù)差異。這種方法允許生成一個(gè)強(qiáng)大且易于放大的工藝，然后只需要通過(guò)GMP-like/GMP 的文檔來(lái)完成，”他評(píng)論道。
例如，在Catalent，R&D級(jí)材料是使用規(guī)?？s小模型生成的，該模型的運(yùn)行參數(shù)設(shè)置點(diǎn)與其潔凈室中的相同，Santos 指出。這種具有代表性的研發(fā)材料已用于工藝開(kāi)發(fā)目的和臨床前研究。 GMP-like 和 GMP級(jí) 質(zhì)粒均使用完全可追溯的原材料和完全一次性的合格設(shè)備生產(chǎn)。操作是相同的，只是共享文檔和質(zhì)量監(jiān)督級(jí)別在這些等級(jí)之間有所不同。
從工藝優(yōu)化到菌株工程
治療和疫苗應(yīng)用所需的 pDNA 數(shù)量不斷增加，質(zhì)粒設(shè)計(jì)和發(fā)酵策略成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。 Varadi 認(rèn)為，為了幫助針對(duì)預(yù)期的巨大市場(chǎng)需求做好準(zhǔn)備，治療藥物和疫苗應(yīng)用所需的 pDNA 數(shù)量不斷增加，質(zhì)粒設(shè)計(jì)和發(fā)酵策略成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。
質(zhì)粒通常通過(guò)高生物量補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝、以大腸桿菌（E.Coli）菌株中重組產(chǎn)生。 Catalent Cell & Gene Therapy 產(chǎn)品開(kāi)發(fā)高級(jí)經(jīng)理 Matthias Craig 表示，通過(guò)解除對(duì)質(zhì)粒復(fù)制的抑制，可以通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)高滴度。在過(guò)去的二十年里，高產(chǎn)質(zhì)粒發(fā)酵工藝得到了極大的發(fā)展和優(yōu)化，”他說(shuō)。
Varadi 表示同意，補(bǔ)料分批方案的實(shí)施提高了 pDNA 產(chǎn)量，提高了批次成功率并優(yōu)化了成本效率。他補(bǔ)充說(shuō)，了解調(diào)節(jié)質(zhì)粒拷貝數(shù)的分子機(jī)制并在下一代質(zhì)粒骨架中實(shí)施它們，將有助于進(jìn)一步提高含有挑戰(zhàn)性基因載荷的質(zhì)粒的產(chǎn)量。
“發(fā)酵確實(shí)變得更加復(fù)雜，以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒生產(chǎn)的預(yù)期目標(biāo)，例如單位生物量的質(zhì)粒產(chǎn)量，”Schleef 觀察到。不過(guò)，他警告說(shuō)，維持質(zhì)粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等更復(fù)雜的問(wèn)題仍有待解決。
Bowen 評(píng)論說(shuō)，上游 pDNA 工藝開(kāi)發(fā)的一些最大因素包括培養(yǎng)基優(yōu)化、補(bǔ)料分批策略和E. coli 菌株選擇。根據(jù) Craig 的說(shuō)法，改進(jìn)E.Coli宿主菌株的工程工作在某種程度上最近比發(fā)酵工藝優(yōu)化更受關(guān)注。 “這些菌株的特點(diǎn)是發(fā)酵滴度更高和/或?qū)е乱子诎l(fā)生缺失/重組事件的核酸序列穩(wěn)定性增加，例如反向末端重復(fù)序列 (ITR) 和長(zhǎng) polyA 尾，”他解釋道。
Craig 指出的另一項(xiàng)重要進(jìn)展是批次和連續(xù)細(xì)胞裂解方法的開(kāi)發(fā)，這些方法可提供高回收率并適應(yīng)更高的生產(chǎn)規(guī)模。同時(shí)，在上游操作中采用一次性設(shè)備顯著降低了交叉污染的可能性，這在生產(chǎn)大量質(zhì)粒的多產(chǎn)品設(shè)施中非常重要，Bowen 觀察到。
上游工藝挑戰(zhàn)
在執(zhí)行 pDNA 生產(chǎn)的上游工藝時(shí)，生產(chǎn)商必須克服許多挑戰(zhàn)。 PlasmidFactory 的研發(fā)經(jīng)理 Ram Shankar 說(shuō)，首先也是最重要的是，pDNA 可以實(shí)現(xiàn)非常高的單位體積產(chǎn)量，但這樣的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于過(guò)表達(dá)的無(wú)毒重組蛋白的產(chǎn)量。
“話雖這么說(shuō)，但如果不能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性和同質(zhì)性，那么簡(jiǎn)單地使每個(gè)細(xì)胞過(guò)量生產(chǎn)質(zhì)粒不會(huì)走得太遠(yuǎn)。在設(shè)計(jì)質(zhì)粒生產(chǎn)的上游工藝時(shí)，必須考慮這些方面，”Shankar 指出。 “在這種情況下，”他繼續(xù)說(shuō)道，“我們制定了一些策略，可以在不依賴(lài)抗生素的情況下保持高生產(chǎn)率，同時(shí)控制產(chǎn)品中關(guān)鍵序列結(jié)構(gòu)的維護(hù)（例如，生產(chǎn)性腺相關(guān)病毒的 ITR 序列 [AAV]生產(chǎn)或用于 mRNA 生產(chǎn)的 polyA 尾）。
根據(jù) Varadi 的說(shuō)法，另一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的高產(chǎn)量生產(chǎn)，這些質(zhì)粒包含挑戰(zhàn)性基因有效載荷（目的基因大小、堿基組成、毒性、選擇標(biāo)記的使用）。同時(shí)，對(duì)宿主細(xì)胞施加顯著代謝壓力的較大質(zhì)粒會(huì)降低培養(yǎng)適應(yīng)性，導(dǎo)致生長(zhǎng)不良和質(zhì)?？截悢?shù)降低。不過(guò)，他補(bǔ)充說(shuō)，嚴(yán)格控制碳源和氮源的供給以及使用替代的非抗生素選擇標(biāo)記可以減少宿主細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)。
Craig 強(qiáng)調(diào)，建議科學(xué)家和藥物開(kāi)發(fā)人員驗(yàn)證他們的質(zhì)粒構(gòu)建體具有非常高的拷貝數(shù)性質(zhì)。 “這一特性與質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)中單點(diǎn)突變的存在有關(guān)，并進(jìn)一步抑制質(zhì)粒復(fù)制，可使質(zhì)粒滴度增加達(dá)5倍，”他解釋道。
Varadi 評(píng)論說(shuō)，導(dǎo)致生長(zhǎng)期蛋白過(guò)早表達(dá)的泄漏啟動(dòng)子也可能不利于上游質(zhì)粒的成功。他補(bǔ)充說(shuō)，一些大的 pDNA 損失也可能發(fā)生在堿裂解過(guò)程中。事實(shí)上，明確定義的堿裂解步驟在減少質(zhì)粒損失方面遠(yuǎn)比避免下游層析操作期間的循環(huán)性能重要得多，他認(rèn)為?！傲呀獠襟E有幾個(gè)需要很好平衡的關(guān)鍵參數(shù)，如緩沖液體積、緩沖液接觸時(shí)間，以及混合過(guò)程中施加的剪切力，”Varadi 解釋道。
質(zhì)粒上游工藝的效率和生產(chǎn)力
質(zhì)粒 DNA 發(fā)酵和細(xì)胞裂解是復(fù)雜的過(guò)程，會(huì)受到許多不同工藝參數(shù)的影響。據(jù)Santos說(shuō)，質(zhì)粒滴度和質(zhì)量，包括超螺旋質(zhì)粒含量，都會(huì)受到直接影響。 “適當(dāng)控制質(zhì)粒復(fù)制抑制和誘導(dǎo)是達(dá)到高單位體積和特異性產(chǎn)量的關(guān)鍵。在發(fā)酵過(guò)程中，這是通過(guò)使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速率的有力控制、適當(dāng)?shù)臏囟仍O(shè)定點(diǎn)和氧氣的可用性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，”她說(shuō)。對(duì)于細(xì)胞裂解，Santos 強(qiáng)調(diào)，在不降解產(chǎn)品的情況下，盡可能多地從E.Coli生物質(zhì)中回收材料至關(guān)重要。 “精細(xì)且平衡良好的堿裂解方法是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的首選單元操作，”她觀察到。
可以采取幾個(gè)步驟來(lái)提高 pDNA 發(fā)酵和裂解過(guò)程的效率和生產(chǎn)力。根據(jù) Varadi 的說(shuō)法，在細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程中，降低細(xì)胞應(yīng)激通常會(huì)提高所產(chǎn)生的 pDNA 的質(zhì)量和數(shù)量。在發(fā)酵過(guò)程中，減少代謝負(fù)擔(dān)和使用精心設(shè)計(jì)的補(bǔ)料分批方案非常有益，因?yàn)榻档痛x負(fù)擔(dān)可以提高產(chǎn)品產(chǎn)量。
Shankar 表示，在批次操作期間更密切地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)關(guān)鍵參數(shù)，例如在線細(xì)胞密度測(cè)量和多次生產(chǎn)運(yùn)行的比較，都在改進(jìn)質(zhì)粒發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 “針對(duì)各種關(guān)鍵工藝（排氣）參數(shù)實(shí)施工藝分析技術(shù)工具，結(jié)合產(chǎn)品參數(shù)（質(zhì)粒含量和同質(zhì)性）的近線分析，有助于揭示工藝變量的隱藏影響，”他說(shuō)。
Varadi 希望看到的一件事是設(shè)備供應(yīng)商推出其設(shè)備的規(guī)?？s小版本（例如，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模）。 “在優(yōu)化規(guī)模縮小的工藝中進(jìn)行工藝開(kāi)發(fā)可以使上游工藝在放大時(shí)更加可靠和穩(wěn)健，”他爭(zhēng)辯道。
轉(zhuǎn)向平臺(tái)化質(zhì)粒發(fā)酵工藝
重組蛋白和單克隆抗體平臺(tái)生產(chǎn)工藝的成功開(kāi)發(fā)產(chǎn)生了針對(duì)其它生物材料（包括 pDNA）建立類(lèi)似平臺(tái)解決方案的愿望。
“我們的目標(biāo)是找到一個(gè)適合所有產(chǎn)品的工藝，而不是針對(duì)不同的質(zhì)粒優(yōu)化每個(gè)工藝。這將提供成本和時(shí)間優(yōu)勢(shì)，最終加速向患者提供治療，”Craig評(píng)論道。 “運(yùn)營(yíng)一個(gè)強(qiáng)大的質(zhì)粒生產(chǎn)平臺(tái)，促進(jìn)項(xiàng)目從 IND 前 [研究性新藥申請(qǐng)] 階段向臨床和市場(chǎng)的過(guò)渡，可以交付具有預(yù)期純度的所需產(chǎn)品數(shù)量，從而大大加快開(kāi)發(fā)時(shí)間表，”他補(bǔ)充道。
然而，這并不容易做到。 “平臺(tái)工藝的開(kāi)發(fā)在一定程度上是可能的，但不可能對(duì)于每種類(lèi)型的質(zhì)粒都有靈丹妙藥，”Schmeer 說(shuō)。 “單個(gè)質(zhì)粒的大小和序列會(huì)對(duì)上游工藝效率產(chǎn)生巨大影響，而這往往沒(méi)有得到充分認(rèn)識(shí)，”他補(bǔ)充道。
Santos 表示同意，平臺(tái)工藝的輸出可變性主要與質(zhì)粒序列本身的特異性有關(guān)。 “大型構(gòu)建體的產(chǎn)量往往較低，攜帶重復(fù)序列（如 ITR 和 polyA 尾）的質(zhì)粒已被證明更容易發(fā)生缺失和重組事件，”她指出。
根據(jù) Bowen 的說(shuō)法，解決方案是通過(guò)在工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中研究各種質(zhì)粒類(lèi)型（大小、復(fù)雜性等）和E.Coli菌株來(lái)開(kāi)發(fā)一個(gè)“靈活”的平臺(tái)，以確定它們對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。這將在生產(chǎn)后續(xù)質(zhì)粒時(shí)提供靈活性。
Craig表示同意，為穩(wěn)健的平臺(tái)工藝增加優(yōu)化靈活性有助于質(zhì)粒數(shù)量的交付，包括滿足具有挑戰(zhàn)性的質(zhì)粒的質(zhì)量規(guī)范。他還指出，使用現(xiàn)成的質(zhì)粒可以進(jìn)一步加快時(shí)間表。 “預(yù)先擁有一組特征良好的質(zhì)粒，例如 pHelper 和 pREPCAP 質(zhì)粒，將為后續(xù)應(yīng)用節(jié)省寶貴的時(shí)間，特別是在與平臺(tái)工藝結(jié)合使用時(shí)，”他說(shuō)。
對(duì)于 Varadi 而言，開(kāi)發(fā)用于上游質(zhì)粒生產(chǎn)的平臺(tái)工藝不僅是可能的，而且是強(qiáng)制性的。 “一個(gè)精心設(shè)計(jì)的平臺(tái)包含多種質(zhì)粒類(lèi)型，并擴(kuò)大了潛在客戶的范圍，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，”他評(píng)論道。 Varadi 補(bǔ)充說(shuō)，成功的關(guān)鍵之一是通過(guò)減少主鏈和目的基因盒內(nèi)的“垃圾”DNA 延伸來(lái)優(yōu)化質(zhì)粒的大小。他還指出，宿主細(xì)胞和質(zhì)粒主干突變的組合（已在文獻(xiàn)中進(jìn)行了表征）有利于拷貝數(shù)增加，應(yīng)針對(duì)工業(yè)目的進(jìn)行評(píng)估。
解決未來(lái)的上游需求
毫無(wú)疑問(wèn)，未來(lái)幾年對(duì)質(zhì)粒 DNA 的需求將繼續(xù)增加。 Varadi 爭(zhēng)辯說(shuō)，所有需要 pDNA 作為原材料的治療類(lèi)型都在大規(guī)模擴(kuò)展，并且需要生產(chǎn)它們的“后臺(tái)”行業(yè)。
“在接下來(lái)的幾年里，高產(chǎn)能生產(chǎn)將不會(huì)是 pDNA 生產(chǎn)商的唯一先決條件；他們還需要有能力以更小的數(shù)量生產(chǎn)多種不同的結(jié)構(gòu)，”Varadi 觀察到。 “滿足需求需要高產(chǎn)能生產(chǎn)，但這不能僅通過(guò)上游工藝優(yōu)化來(lái)實(shí)現(xiàn)。廣泛實(shí)施一次性技術(shù)和簡(jiǎn)化的可放大性解決方案作為從非 GMP 工藝開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室到 GMP 車(chē)間的鏈接將是必要的，”他堅(jiān)持說(shuō)。
Shankar 表示，規(guī)模和質(zhì)量確實(shí)是未來(lái) pDNA 生產(chǎn)必須解決的兩個(gè)關(guān)鍵方面。他同意“通過(guò)采用一次性技術(shù)實(shí)施上游工藝的 GMP 質(zhì)粒生產(chǎn)將扭轉(zhuǎn)新型先進(jìn)治療藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)潮流?！?/span>
