使用一次性系統連續生產 mAb 可以在更短的時間內用更小的設備生產更多的 mAb，更準確地說，體積減少了 5-10 倍。這是通過提高生產力和減少非增值操作（例如保持步驟）來實現的，這同時降低了資本和運營費用。這與對過程控制和設備的更高要求、高培養基消耗和通常低產品滴度形成鮮明對比。使用一次性系統的這種方法相關的典型特異性生產率約為 1 g/L/day，產品滴度在 0.3 和 1 g/L 之間。然而，最近，WuXi Biologics 使用其實驗室規模的連續 USP 平臺生產融合蛋白，報告了 2.5 g/L/day 的前所未有的生產力。
幾年來，人們對連續工藝越來越感興趣，尤其是對于 mAb 生產，這也是由于連續操作對產品質量和產品供應的積極影響。因此，有可能：(1) 在穩態條件下操作時獲得一致的產品質量（這在補料分批模式下可能會出現問題，具體取決于培養時間），(2) 降低人為錯誤的風險，以及 (3)快速響應不斷變化的供應需求。此外，通過始終如一的高細胞活性，產品中的雜質（例如 HCP 和細胞碎片）水平保持在較低水平。
2015 年，Godawat 等人描述了實驗室規模的第一個完全連續的 mAb 生產，工作體積為 12 L。該工藝運行了 31 天，通過 ATF、Protein A層析、病毒滅活、陽離子交換層析和最終膜過濾進行全自動產品純化。2019 年，Arnold等人報告了首次完全連續中試規模 mAb 生產 (50 L) 的結果。作者計算出，通過將補料分批設施（4 × 12.5 m3生物反應器）替換為連續式設施（5 × 2 m3 連續運行的一次性生物反應器和純化系統），可以節省 15% 的成本。同年，荷蘭-澳大利亞公司 Biosana 獲得了一種治療性生物仿制藥 mAb (Omalizumab) 的 1 期臨床試驗批準，該試驗采用完全連續的生產方法（工作體積為 50 L 的生物反應器），并于 2020 年 3 月取得了可喜的結果。但是，正如前文中提到的那樣，在完全連續的設施中生產的商業 mAb 仍處于臨床開發階段。
連續一次性上游工藝
相反，實施連續 USP 的混合工藝方法自 1994 年以來一直用于生產商業生物治療產品（即使它們沒有被宣布為連續的一次性 USP）。行業還報道了其目前被用于生產越來越穩定的分子的趨勢。這種連續灌流工藝（其中營養耗竭的培養基和產品連續排出）的目標是實現一種穩定狀態，在這種狀態下，生產率和產品質量可以長時間保持且偏差最小化。
為了在 30 到 90 天的工藝操作期間保持必要的恒定 VCD 和高細胞活性，必須根據生長速率調整細胞廢棄率。在穩定條件下連續 USP 運行的時間越長，生物反應器的時-空產率就越高。連續 USP 的關鍵組成部分是一次性生物反應器，包括其傳感器和自動化技術，以及前文中介紹的細胞截留裝置，特別是 ATF 設備，其已被證明可以支持這樣的連續上游工藝，其中，目標特異性生產率超過 1 g/L/day。且中試和工業規模工藝傾向于使用一次性 ATF 系統。
下圖顯示了使用連續 USP 的現代mAb 生產流程的典型代表性示意圖。接種液制備是在帶有灌流袋的波浪式生物反應器中進行的，該灌流袋直接用 HCD冷凍管接種。攪拌式一次性生產生物反應器與 ATF 系統一起連續運行。雖然可以將多種培養基補液添加到生產生物反應器中，但通過控制收獲流和廢棄流來保持體積恒定。它們的比例取決于生產細胞系的生長速度。在這種情況下，使用優化的灌流培養基是提高工藝穩定性和降低工藝成本的重要一步。
現代 mAb 生產工藝的典型連續USP 流程圖。
高 VCD（> 1 x108 cells/mL）的長期運行導致了對生產生物反應器及其內部和外部支持設備的高要求。Thermo Fisher Scientific HyPerforma DynaDrive 系列的 50 L 生物反應器是專門設計用于非常高細胞密度的連續和強化補料分批操作的下一代攪拌式一次性生物反應器的一個例子。Hyperforma DynaDrive 系列包括 50 L、500 L 和 5 m3 版本的生物反應器，帶有立方體形袋和特殊的調節比，即 10:1（50 L）和 20:1（500 L，5 m3），而不是通常的 5:1。這意味著該系列生物反應器已經可以在其最大工作體積的 10% 甚至 5% 下運行。它們配備了一個低剪切鉆孔鼓泡（能夠產生足夠的氧氣傳輸和二氧化碳脫氣）和一個帶有多個雙葉葉輪的靈活傳動系統，能夠在中等轉速和葉尖速度下實現 < 60 秒的混合時間。
ABEC、Cytiva、Merck Millipore、PALL 和 Sartorius 提供其它適用于生產規模灌流的一次性生物反應器。從生物反應器中收獲的產品液流，例如與 ATF 系統一起使用時，被傳輸到 DSP，在那里純化 mAb。
連續一次性DSP
使用連續操作的一次性設備可以節省緩沖液、填料和耗材。更具體地說，研究結果表明，與經典的不銹鋼批次工藝相比，使用一次性連續 DSP 可以節省 36-55% 的成本。
雖然捕獲步驟通常仍使用Protein A柱在結合-洗脫模式下進行，但有策略將幾根柱子并聯并循環運行，這意味著可以使用小得多的柱子。這種方法被稱為多柱層析或逆流層析，并且在設計上有所不同。在這里，生產生物反應器后的保持步驟被消除，緩沖液和填料的消耗減少。Sartorius 的 BIOSMB 平臺和 ARTeSYN Biosolutions（Repligen子公司） 的系統是連續一次性使用的多柱層析系統的例子，它們可用于捕獲步驟中的結合-洗脫層析法和隨后的流穿純化步驟。它們是符合 GMP 的多柱層析系統，具有完全一次性的產品流路。Merck和Bayer都在連續 mAb 生產過程中使用BioSMB 系統進行捕獲步驟和陽離子交換或混合模式層析。
到目前為止，精純步驟大多在結合-洗脫模式下進行。通常，使用離子交換層析法、疏水相互作用層析法或混合模式層析法進行純化，以進一步純化目標產物。在這種情況下，改為連續使用可能會產生與捕獲層析法相同的積極效果。通過結合污染物而不是目標產品使連續操作變得可行。然后目標產物流過柱子。一旦層析柱充滿污染物，就會發生污染物穿透，必須更換層析柱。雖然沒有實現真正的連續模式，但這種流穿模式被認為是偽連續的。Gupta等人使用耐鹽的一次性陰離子交換膜在流穿模式下實現了超過 90% 的 HCP 去除率，而使用傳統填料時的去除率低于 70%。
一份報告描述了一種多柱層析法，其中捕獲步驟和兩個精純步驟串聯連接。三個平行流路交替上樣，使用一次性膜吸附。在Sanofi，這種在 500 L 工藝中實施的操作模式使層析柱尺寸減少了 66%，抗體純化工藝的生產率提高了 10 倍。
目前，通常的做法是在捕獲步驟之后執行病毒滅活步驟，并且通常在最終超濾/洗濾之前執行除病毒過濾步驟。病毒滅活通常通過將 pH 值轉移到酸性范圍來進行。對于傳統（批次）DSP 環境中的病毒滅活步驟，使用了混合罐，添加酸，然后用堿中和，這里，存在兩種實現連續操作的方法：作為第一種選擇，經典方法可以采用兩個交替操作的一次性混合器。例如，Pall的 Cadence 病毒滅活系統就使用了這種方法。第二種可能性是使用活塞流反應器，在反應器入口處將酸添加到產品流中。產品在活塞流反應器中的停留時間內保持低 pH 值，之后在出口處通過添加堿進行中和。為了收斂到最佳活塞流條件，應避免返混，并將產品停留時間的差異保持在最低限度。除了通過低 pH 值滅活外，還可以在活塞流反應器中使用 UV-C 輻射滅活病毒。然而，輻射會導致蛋白質損傷。目前市場上沒有用于紫外線病毒滅活的商用一次性設備。
降低病毒的第二步，即除病毒過濾，在精純步驟之后。這通常涉及死端納濾。這些過濾器可成功地用于連續 DSP，即在很長一段時間內和低流量條件下，已經在各種研究中進行了描述。在連續運行中，兩個單獨的過濾器并聯連接。一旦一個過濾器達到其處理量限制，例如由于壓力限制，系統會自動切換到另一個過濾器。然后在接封管機的幫助下更換第一個過濾器。
最近，針對批次和連續培養，有小組研究了用于除病毒過濾的4種不同過濾器與 mAb 生產工藝相關的性能。在以 0.3 L/m2/h 的流速連續過濾 72 小時期間，應用啟停方案來確定哪些過濾器適合在低壓環境中連續運行。兩個測試的第二代過濾器，即 Pall Pegasus Prime 和 Sartorius Virosart HF，能夠在整個過濾時間內，在至少 20 L/m-2 的條件下，使log降低值保持在 4 以上。額外的短期和長期停止試驗以研究壓力波動的影響，在一段時間后顯示出穩定狀態，使連續運行成為可能。然而，對于基于一次性使用的連續操作模式而言，高達 1 bar 的壓力降低可能允許噬菌體在操作開始時通過更大的過濾孔流動。
通常，mAb 制劑需要幾個 TFF 步驟，為此可以使用一次性設備。然后通過超濾濃縮產物，通過洗濾轉移到適當的緩沖系統中，并通過第二個超濾步驟達到最終濃度。這里，SPTFF可用于連續應用。過濾時間可以通過更高的膜面積和更低的流速增加到所需的程度，以至于一個連續的過濾步驟就足夠了。該方法可用于蛋白質濃縮和洗濾。對于這兩個步驟，一次性設備版本已經可用。SPTFF 洗濾過程中的緩沖液消耗量相對較高，但可以通過使用多個 SPTFF 組件以及在逆流洗濾方法中從晚期到早期步驟進行緩沖液回收來減少。
整體成本比較
在比較批次工藝和連續工藝時，根據工藝模式考慮成本與技術可行性同樣重要。雖然有幾份報告比較了批次和連續工藝模式之間的成本，但其中大多數沒有考慮完全基于一次性使用的生產，而是考慮混合工藝。然而，常識是，基于一次性使用的生產有利于較小的生產規模，其中一次性設備的有限尺寸，特別是生物反應器的工作體積，并不構成挑戰。此外，通?？梢酝ㄟ^使用連續生產工藝來實現更小的工廠規模。最近的一項研究報告稱，補料分批工藝導致 mAb 生產的商品運營成本 (COG) 為 $99/g，而連續工藝的商品運營成本 (COG) 為 $51/g。這種成本差異也部分是由于占地面積更小以及儲罐更少，這導致設施成本降低了66%。分解為單個單元操作，下游部分的填料成本降低導致連續工藝中的耗材成本降低了 68%。基于一次性使用的連續上游工藝也已被證明是具有成本效益的選擇，但是，如果使用一次性設備執行上游和下游操作，則會看到更大的好處，如多個 COG 模擬研究所示。
在并行化和靈活性方面也看到了成本效益，這可以通過一次性設備的應用得到支持。消除清潔和在線滅菌程序降低了設備的復雜性，這本身就降低了資本成本并減少了停機時間。據計算，從 1,300 kg 的年生產規模和 3 g/L 的上游滴度來看，使用 2,000 L 生物反應器的完全一次性 mAb 生產成為優于相同或更高上游工作體積的不銹鋼選項的優選選擇。在較高的上游滴度下，一次性使用的變化總是有利的。如果分解為單元操作，當應用連續工藝而不是批次工藝時，尤其是在可能的情況下與基于一次性使用的方法結合使用時，多個步驟的成本節省可能很大。更具體地說，根據抗體生產工藝中Protein A捕獲步驟的滴度和規模，可實現超過 20% 的節省。Pollard等人使用凈現值 (NPC) 估算三種 mAb 生產方案的成本，這構成了產品的凈現值，沒有銷售利潤。在一種情況下，將傳統不銹鋼設備與一次性設備進行比較，分別用于滴度高于 10 g/L 的強化工藝和完全連續的工藝。初始工藝使用 6 × 15,000 L 生物反應器，滴度為 3 g/L，一次性生物反應器工藝使用 6 × 2,000 L 生物反應器。連續灌流工藝的生產率設定為 2 g/L/day。在 1 噸的年產量下，強化一次性和連續生產工藝的 NPC 降低了約 60%。
進一步強調簡化操作和提高工藝穩健性以及成本效率，還應關注用于監控和控制策略的過程分析技術，特別是對于一次性設備，因為在基于一次性使用的工藝中還不能完全達到類似程度的傳感器應用。
總結
分析顯示，全球治療性單克隆抗體市場在不久的將來會繼續增長，預計到 2025 年收入將達到 3,000 億美元。在這個框架中，使用一次性系統強化和連續的 USP 和 DSP 單元操作非常適合減少 mAb 開發和生產的時間和成本。關于連續工藝，正在積極追求 30 至 120 天的運行時間。連續 USP 已經用于一些獲批的 mAb，而第一個完全連續生產的 mAb 目前已經在臨床試驗中。然而，仍有挑戰需要克服。對于 USP，這歸因于生物反應器袋（及其組件，如葉輪、密封件、鼓泡等）和用于灌流裝置的塑料的堅固性以及機械穩定性。由于長期使用，對袋子的設計要求很高，特別是攪拌罐反應器的葉輪、鼓泡、廢氣過濾器的設計和泡沫控制。為此，適于連續使用級別一次性塑料是必不可少的。需要保證氧氣傳遞系數 > 15 h-1 和足夠的 CO2 脫氣，以及在中等攪拌器葉尖速度下的足夠的單位功率輸入。此外，還需要：(1) 改進的管路和連接器，(2) 改進的、新的一次性傳感器和探針，(3) 安裝冗余傳感器和過濾器以及相應的更換策略，以及 (4) 一次性使用泵可在低流量（0.1 L/min – 2 L/min）下運行且保持高精度。這四點同樣適用于 DSP。
如前所述，另一個涉及連續 USP 和 DSP 單元操作的挑戰是連續工藝溶液暴露于 L&E 的影響，工藝時間可能長達 4 個月。因此，必須確認所有 USP 和 DSP 單元操作的L&E 特征和相應的緩解策略（例如水或緩沖液沖洗、可析出物清除、一次性設備更換）。如果成功，目前使用一次性系統生產 mAb 的經典和強化補料分批工藝將越來越多地被連續操作方法所取代。
原文：J.Muller, M.Teale, S.Steiner, et al., Intensified and Continuous mAb Production with Single-Use Systems. Cell Culture Engineering and Technology, 2021.
