在創(chuàng)新藥等生物制藥的過程中，建立菌種庫的意義在于利用菌種庫系統(tǒng)進(jìn)行充分的質(zhì)量檢測并以此最大程度的控制和減少污染和菌種的性質(zhì)改變。科研人員為了達(dá)到菌種庫建立的目的，在建立菌種庫時(shí)需要菌種庫具備足夠數(shù)量的菌種和維持菌種的均質(zhì)性，用以確保研發(fā)和生產(chǎn)過程中所用的菌種的來源的一致性。
關(guān)鍵詞
三級種子庫
菌種庫的構(gòu)建
什么是三級菌種庫？
菌種建庫建立的三級種子庫包括
1. 原始種子庫(pre-master cell bank/research cell bank, PCB/RCB）
2. 主代種子庫(master cell bank,MCB)：從原始種子批傳代、擴(kuò)增后保存的為主種子庫
3. 工作種子庫(working cell bank,WCB)：從主種子庫進(jìn)行批傳代、擴(kuò)增后保存即為工作種子庫
每批種子庫都應(yīng)按規(guī)程的要求進(jìn)行保管、檢定和使用。為了保障生物制品的安全性，必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的檢測，確定其達(dá)到相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求。
三級菌種庫不僅僅是簡單的將菌種按照傳代或者特性分為三個級別，而是對于菌種的保存與運(yùn)用設(shè)置了三種基礎(chǔ)的質(zhì)量和程序要求，以確保菌種在長期的、大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用中的穩(wěn)定性和可溯源性等。
主菌種庫與工作菌種庫的區(qū)別
主菌種庫是從PCB分離出來的單菌落，然后對該單菌落經(jīng)過傳代，增殖后混成均質(zhì)菌懸液，定量分裝于凍存管，并采取適當(dāng)方法保存的用于制備工作菌種庫的菌種來源。
工作菌種庫是由主菌種庫再傳代增殖后，混成均質(zhì)菌懸液，定量分裝于凍存管，并采取適當(dāng)方法保存的用于商業(yè)化生產(chǎn)的菌種來源。發(fā)酵所用的菌種除了常規(guī)的檢測指標(biāo)，如菌落形態(tài)外觀、生產(chǎn)能力和其他生化指標(biāo)外，還需要檢測：如污染菌檢査（微生物、真菌、支原體的檢測分析）、組分檢測、孢子量檢測等才能被作為工作菌種庫保存和使用。
在實(shí)際運(yùn)用過程中，部分企業(yè)將主菌種庫和工作菌種庫簡單的以傳代次數(shù)和保存條件進(jìn)行劃分。
這種區(qū)分方法是絕對錯誤的，在短期生產(chǎn)或無后續(xù)研究的情況下或許不會出現(xiàn)缺漏，但只要進(jìn)入長期、大規(guī)模生產(chǎn)階段，這種區(qū)分方法就帶來工作菌種的質(zhì)量和性質(zhì)不穩(wěn)定等諸多問題。出現(xiàn)以上問題的主要原因是沒有理解主菌種庫與工作菌種庫之間的關(guān)系。
1、來源的不同，MCB來源于初始菌株的單菌落，如誘變后的高產(chǎn)菌種，在經(jīng)過穩(wěn)定性驗(yàn)證后，從這一高產(chǎn)單菌落中進(jìn)行增殖獲得的一系列的菌懸液。WCB是從MCB擴(kuò)增而來，但并不出自于MCB的單菌落。
2、對法規(guī)理解偏差，如果每年的使用量特別小，當(dāng)MCB足以支持生產(chǎn)需要時(shí)，便沒有必要設(shè)置WCB。
3、MCB和WCB在工藝和質(zhì)量放行的標(biāo)準(zhǔn)上存在不同。一般MCB比WCB在使用和標(biāo)準(zhǔn)上更嚴(yán)格。
什么樣的菌種才可以作為工作菌種？
微生物發(fā)酵產(chǎn)品通常會采用化學(xué)、物理誘變方法或者基因技術(shù)對微生物菌種進(jìn)行選育或基因改造，得到一個更高產(chǎn)能效率的新菌種。得到的高產(chǎn)菌株，如果經(jīng)過生產(chǎn)能力，傳代穩(wěn)定性，組分檢測、孢子量等檢測指標(biāo)，尤其是雜質(zhì)指紋比較后，確定沒有問題后就可以建立新的主菌種庫，而用于商業(yè)化生產(chǎn)。
菌種庫的構(gòu)建
菌種庫構(gòu)建過程主要需要注意以下幾個方面
1. 建庫用菌種的溯源性
2. 菌種建庫過程合規(guī)性
3. 建庫菌種的檢定要求
4. 菌種傳代穩(wěn)定性研究
一、溯源性
為保證菌種的可溯源性菌種庫構(gòu)建資料要求具備基因、載體和宿主細(xì)胞的來源及改造過程。其來源明確清晰，切實(shí)可靠，其演化歷史也必須清楚。
目的基因：
為確保目的基因的可溯源性菌種庫必須確定其來源、設(shè)計(jì)和改造過程，并且要求來源明確清晰，歷史演化過程清楚。
表達(dá)載體：
為保證表達(dá)載體的可溯源性菌種庫構(gòu)建資料要求具備表達(dá)載體的來源、名稱、結(jié)構(gòu)等信息，說明重組質(zhì)粒的構(gòu)建和檢定過程。載體來源應(yīng)當(dāng)清楚，明確其出處以及可靠性。
宿主細(xì)胞：
宿主細(xì)胞的來源要明確，提供其名稱、生物學(xué)特性，檢定結(jié)果等信息。
二、菌種建庫過程合規(guī)性
建庫流程：依照法規(guī)規(guī)定，從篩選到的高表達(dá)菌株單克隆經(jīng)反復(fù)純化擴(kuò)增驗(yàn)證后，凍存于-80℃，即為原始種子庫。取一只原始種子，復(fù)蘇后擴(kuò)增驗(yàn)證，然后混合一定濃度的甘油后在-80℃凍存，即為主種子庫。取主種子進(jìn)行復(fù)蘇后擴(kuò)增驗(yàn)證，然后混合一定濃度的甘油后在-80℃凍存，即為工作種子庫。所有的種子都要嚴(yán)格記好株名、批號、編號、凍存日期、分裝數(shù)量、放置位置及取用記錄等。
①需在GMP體系完成建庫工作，建庫流程、儲存、運(yùn)輸過程都要形成SOP管理文件。
②保證均質(zhì)性，如果是使用了多個容器培養(yǎng)，分裝前需要有合適的方法充分混勻。
③為保證工作種子庫、主種子庫與原始種子庫的生物學(xué)特性一致，建庫過程中不得有單克隆挑選和菌種篩選的行為。
星耀小TIP：
GMP標(biāo)準(zhǔn)（藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范）是為保證藥品在規(guī)定的質(zhì)量下持續(xù)生產(chǎn)的體系。它是為把藥品生產(chǎn)過程中的不合格的危險(xiǎn)降低到最小而訂立的。GMP包含方方面面的要求，從廠房到地面、設(shè)備、人員和培訓(xùn)、衛(wèi)生、空氣和水的純化、生產(chǎn)和文件。
三、建庫菌種的檢定要求
①菌落形態(tài)及抗生素抗性，考察菌種在含與不含抗生素培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)及抗生素抗性。
②生化反應(yīng)，考察工程菌是否具有典型的大腸桿菌生化反應(yīng)。
③染色鏡檢，考察工程菌菌體形態(tài)及革蘭氏類別。
④重組表達(dá)載體酶切檢定，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒酶切后DNA片段大小符合理論值。
⑤基因序列測序，驗(yàn)證重組表達(dá)載體上的目的基因序列的正確性。
⑥電鏡觀察，通過電鏡觀察菌體形態(tài)，支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染情況。
⑦菌體目的蛋白表達(dá)檢定，通過SDS-PAGE檢測分析重組質(zhì)粒是否表達(dá)目的蛋白。
⑧菌體表達(dá)蛋白免疫原性檢查，通過Western-blot檢測分析重組質(zhì)粒表達(dá)的重組蛋白是否具有正確的免疫原性。
《中國藥典》三部中規(guī)定了細(xì)胞基質(zhì)的質(zhì)量要求，包括：細(xì)胞鑒別（種屬、株及專屬特性）；外源因子污染檢查（包括病毒性及非病毒性內(nèi)外源因子）；成瘤性及致瘤性檢測；染色體核型；均一性及穩(wěn)定性等。
四、菌種傳代穩(wěn)定性研究
根據(jù)《中華人民共和國藥典》相關(guān)要求，種子庫要開展傳代穩(wěn)定性研究，明確限傳代次數(shù)，使用壽命，評估是否能夠滿足未來商業(yè)化生產(chǎn)需求。在開展傳代穩(wěn)定性研究時(shí)應(yīng)在模擬實(shí)際的生產(chǎn)條件下開展。通常對重組質(zhì)粒穩(wěn)定性和表達(dá)穩(wěn)定性研究的方法為：對種子庫菌種多代次培養(yǎng)，通過雙酶切檢測與菌體PCR檢測，確定傳代50次后質(zhì)粒是否丟失。通過對傳代50代的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對菌體表達(dá)的目的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE檢測，確定傳代后的表達(dá)穩(wěn)定性。
總結(jié)
綜上所述，三級菌種庫的建立不僅僅是為了為菌種的保存和追溯提供切實(shí)的依據(jù)，而且是在GMP審查以及IND申報(bào)時(shí)所必需的數(shù)據(jù)來源。因此在建立三級菌種庫之時(shí)所需要考慮的不僅包括菌種庫本身的基本要求，而且要把IND申報(bào)的要求考慮在內(nèi)。在保證符合國家關(guān)于菌種庫建立的要求之外，符合IND申報(bào)和GMP體系的要求。
