開發可負擔且可獲得的COVID-19疫苗的熱潮不僅加速了基于病毒載體、mRNA和pDNA的疫苗等治療模式的研發，而且還向生物工藝界提出了挑戰，要求其解決這些重要救命藥物生產過程中與規模放大相關的獨特挑戰。本文闡述了目前的一些想法和經驗，以消除瓶頸的潛在挑戰，從而將腺病毒載體技術放大至2000 L及以上。
腺病毒載體是將基因遞送至特定人類細胞的有吸引力的載體，已被廣泛用于COVID - 19疫苗和基因治療。這些載體可以容納大的轉基因，轉導靜止和分裂的細胞，并且不整合到宿主的基因組中。越來越多的臨床試驗基于將腺病毒用作轉基因遞送載體(用于基因治療)、疫苗載體以及用作載體(用于溶瘤病毒療法)。
腺病毒載體技術已經存在很長一段時間了，越來越關注病毒載體生產和開發的關鍵驅動因素包括降低產品成本(包括大規模生產以及降低原材料成本)的需要以及提高最終產品的純度水平。
圖1. 在2000L規模條件下，生產腺病毒載體的生產流程示意圖。
使用HEK 293宿主的生產過程的總體示意圖如圖1所示，它包括了上游工藝過程中細胞生長和病毒感染階段的逐級放大，以及下游工藝過程中一系列的過濾、濃縮和層析步驟，以生產高純度的原料藥。
盡管該工藝單元的操作看起來并不復雜，但由于細胞生長不穩定、病毒滴度低、產物聚集、目的產物分離效率低，以及處理大體積病毒感染相關的操作復雜性，大規模生產仍然是一個重大挑戰。表1詳細說明了工藝規模放大期間預計面臨的挑戰和可能采取的緩解策略。
表1. 病毒載體規模放大過程中預期的挑戰以及潛在的緩解策略。
上游挑戰和緩解策略
在大規模生物反應器中以HEK293為基礎的病毒載體血清型生產的整體策略圍繞三個因素:在放大階段最優的HEK293細胞生長，在生產過程中獲得最優的感染復數 (MOI) 的優質病毒種子以及最優的工藝參數、以獲得最高的病毒滴度。
盡管HEK293細胞已被廣泛應用于生物制藥領域，但選擇最佳培養基、補液添加物和工藝參數以避免細胞聚集、細胞生長滯后和活性下降是至關重要的。在生物反應器中，典型的細胞培養參數，如pH、溫度和溶氧水平，通常可以得到很好的控制，但與其它常用的哺乳動物細胞類型相比，HEK293細胞的生長對溶氧水平、滲透壓、培養基補液策略和代謝物水平表現出更高的敏感性。因此，開發控制這些重要參數的控制策略對于實現一致的細胞生長和產物滴度是非常關鍵的。
在生產過程中，用于感染HEK293細胞的病毒種子的質量是另一個重要參數，因為它定義了在生產過程中可感染單個HEK293細胞的病毒數量，因此，在病毒滴度方面影響批次產出。要避免的最重要的因素之一是細胞聚集，這可能導致非最佳的生長以及感染效率的損失，從而導致收獲結束時生產力的降低。雖然在某些情況下，添加抗聚集試劑可能有助于解決聚集問題，但在大多數情況下，未達到最佳狀態的攪拌是根本原因。因此，攪拌速率需要通過設計良好的策略 (P/V、Kla、剪切應力、葉尖速度等) 來優化，以避免任何傳質和混合限制，但同時保持低剪切應力。此外，我們需要開發病毒滴度定量分析(顯著縮短TAT)來可靠地估算MOI，從而用于計算用于感染的病毒種子體積。
最后，感染階段的參數，包括溫度、最適細胞周期階段、感染時的細胞密度、感染持續時間和培養的pH值，對收獲期末的病毒滴度產量有顯著影響。這些參數需要使用多變量設計的實驗方法仔細優化，以獲得最大的病毒滴度產量。
下游挑戰和緩解策略
大規模下游生產的主要挑戰是回收產品質量和純化過程結束時的穩定性不一致。在各種單元操作過程中，pH值、熱應力或機械應力均可引起病毒顆粒聚集。這些聚集的顆粒非特異性且“強烈”地結合到填料上，導致重大的產物損失。為了盡量減少聚集造成的損失，整個中游和下游都需要精心設計。細胞裂解、核酸內切酶處理和TFF等單元操作需要優化，以避免剪切力，這可能也有助于降低病毒顆粒的聚集。
層析法被認為是純化的主要模式，但當與切向流過濾相結合時，其效率可以提高好幾倍。在大規模生產中，TFF是一種強大的分離工具，它顯著減少了后續層析步驟的產品處理體積以及雜質負荷( 小蛋白、培養基成分和其它不需要的雜質)，從而使層析專注于特定雜質的分離 (如圖2所示)。
腺病毒對剪切敏感，在濃縮和換液過程中衣殼的任何構象變化都可能導致高聚集和低回收率，因此優化這一步驟、以使剪切條件最小化是必要的。雖然氯化鎂、聚山梨醇酯80和氯化鈉等緩沖液中的一些穩定劑可以幫助穩定病毒顆粒，但其它策略與最小化工藝保持時間以及在較低溫度下保持工藝中間產物有關。
圖2. 使用切向流過濾進行病毒收獲裂解液的濃縮和換液，切向流過濾是病毒載體純化中的關鍵步驟。
對于病毒載體，另一個可能隨著規模放大而加劇的問題是在純化過程結束時將不需要的空衣殼與包裝的完整衣殼(所需產物)進行穩健的分離，以達到所需的空衣殼和完整衣殼的比例。
密度梯度離心機可以有效地將空衣殼與完整衣殼分離，但該技術耗時長，且存在可放大性限制。最廣泛使用的層析步驟是陰離子交換，操作接近中性環境，允許在梯度洗脫條件下選擇性分離空衣殼。其它層析，如陽離子交換，和膜層析也可以用于獲得高度純化的完整衣殼。
批次間最終產物的不一致性主要是由于下游層析操作中空衣殼和完整衣殼分離不良所致。對離子交換層析單元操作的充分優化有助于完整衣殼的富集，以獲得較高的回收率以及最終產品中這兩種物質的一致比例。
病毒載體生產的分析工具
開發大規模、優化的病毒載體生產、收獲和純化工藝要求具有準確和可重復的分析工具，以監測質量屬性，確保安全、一致、高質量和有效的產品。表2列出了通常用于過程中產物表征和控制的具體分析方法，以確保過程和產物的穩健性。這些分析技術不僅有助于工藝優化 (提高病毒滴度和步驟回收率)，而且是工藝規模放大總體成功的關鍵指標。
表2. 病毒載體生產中，增強過程理解、緩解規模放大相關挑戰的分析工具。
設施設計和適當的清潔控制
由于病毒載體產品的特性，為其精心設計工廠設施是實現可預測和穩健運營結果的關鍵。腺病毒載體生產的主要挑戰之一是過早感染HEK293細胞的風險，這可能導致細胞生長不良和批次提前終止，導致產品產量不理想。因此，根據設計，設施中的不同潔凈室需要在人員物料移動、空氣處理單元的隔離以及病毒區和非病毒區之間的其它程序控制方面進行適當的控制。此外，還需要建立有效的清潔、衛生和環境監測程序，并輔以產品特異性分析檢測，以控制和規避任何病毒污染的殘余風險。
總結
隨著細胞和基因治療領域的重點轉變為產品的商業化，以解決疾病領域日益增長的需求，生產商開發大規模、穩健的工藝勢在必行，這些工藝既要滿足嚴格的監管要求，又要旨在推動全球范圍內的可負擔性和可及性。然而，具體的技術和操作挑戰需要通過精心設計的實驗方法和經驗知識來緩解，以確保成功的工藝放大。
