細(xì)胞培養(yǎng)基的范圍從簡(jiǎn)單的成分到復(fù)雜的化學(xué)成分明確的混合物。它們可能包含許多化學(xué)成分，每一種都具有獨(dú)特的特性，其中任何變化都可能影響細(xì)胞培養(yǎng)過程和正在生產(chǎn)的產(chǎn)品。雖然可以使用眾所周知的經(jīng)典方法（例如傅里葉變換紅外光譜）輕松識(shí)別簡(jiǎn)單物質(zhì)，但在處理復(fù)雜混合物時(shí)，這變得更具挑戰(zhàn)性。
行業(yè)工藝正在得到改進(jìn)，以確保良好的生產(chǎn)規(guī)范和控制措施到位。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的一種方法是不再使用非化學(xué)限定的原材料。培養(yǎng)基用戶無法量化每種培養(yǎng)基成分，必須找到適合預(yù)期用途的技術(shù)并接受某些產(chǎn)品變化的受控風(fēng)險(xiǎn)。如果培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分未知，則可能會(huì)使用次優(yōu)來源或原材料，并可能導(dǎo)致批次損失。這可能代價(jià)高昂，并且會(huì)顯著影響進(jìn)度和市場(chǎng)供應(yīng)。
國(guó)際協(xié)調(diào)委員會(huì)的 Q7A 活性藥物成分良好生產(chǎn)規(guī)范指南要求生物制藥最終用戶除了使用供應(yīng)商的分析證書，至少進(jìn)行一種檢測(cè)，以確認(rèn)每個(gè)批次材料的一致性。因此，許多最終用戶復(fù)制了培養(yǎng)基制造商執(zhí)行的基本 ID 指紋測(cè)試，作為其內(nèi)部質(zhì)量控制流程的一部分。這種復(fù)制不會(huì)給培養(yǎng)基的指紋增加任何價(jià)值。
我們行業(yè)中的許多人都認(rèn)識(shí)到主要挑戰(zhàn)包括：
缺乏指紋確認(rèn)細(xì)胞培養(yǎng)基和相關(guān)原材料的標(biāo)準(zhǔn)指南。
目前的測(cè)試可能表明配方或質(zhì)量屬性，但不表明過程影響/適合目的。
目前用于指紋識(shí)別培養(yǎng)基配方的 ID 方法很麻煩，并且通常需要不同的分析技術(shù)，例如，高效液相色譜。
我們?cè)诒疚闹忻枋龅呐囵B(yǎng)基指紋識(shí)別的三層方法可幫助您定義一種替代方法，該方法將允許驗(yàn)證培養(yǎng)基質(zhì)量和指紋識(shí)別。它可以幫助您根據(jù)原材料特性、培養(yǎng)基特性目標(biāo)以及培養(yǎng)基制造商或用戶現(xiàn)場(chǎng)可用的資源，選擇合適的方法進(jìn)行傳入 ID 測(cè)試。它基于避免重復(fù)測(cè)試的基本原則，使培養(yǎng)基用戶可以信任培養(yǎng)基制造商提供的數(shù)據(jù)。
圖 1：培養(yǎng)基指紋識(shí)別的三層測(cè)試方法。
在這種情況下：
培養(yǎng)基供應(yīng)商有責(zé)任執(zhí)行 1 級(jí)基本 (ID) 測(cè)試和一種 2 級(jí)定性指紋識(shí)別，以確認(rèn)所提供培養(yǎng)基的身份/一致性或質(zhì)量沒有差異。
建議最終用戶執(zhí)行 2 級(jí)定性指紋識(shí)別，以增加材料表征的維度。該測(cè)試不應(yīng)與培養(yǎng)基供應(yīng)商完成的 2 級(jí)定性指紋識(shí)別相同。
根據(jù)材料的工藝知識(shí)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，可能需要對(duì)特定化合物進(jìn)行 3 級(jí)定量指紋識(shí)別。這可以由供應(yīng)合作伙伴作為附加服務(wù)執(zhí)行，也可以由最終用戶直接執(zhí)行，具體取決于資源和它們之間的關(guān)系。
下面，我們將描述測(cè)試方法中每個(gè)級(jí)別的期望。此目的是確認(rèn)細(xì)胞培養(yǎng)基適用于目的，并且應(yīng)用的指紋識(shí)別水平來自過程知識(shí)和要求。
級(jí)別 1：基本 (ID) 指紋識(shí)別
這被定義為能夠在總體水平上將一種培養(yǎng)基與另一種培養(yǎng)基區(qū)分開來。所描述的內(nèi)容不會(huì)唯一地標(biāo)識(shí)每個(gè)化學(xué)定義的培養(yǎng)基；相反，它可以區(qū)分培養(yǎng)基 A 和培養(yǎng)基 B。
物理化學(xué)測(cè)試方法通常用于基本 (ID) 指紋識(shí)別。這些都是簡(jiǎn)單的技術(shù)，表明培養(yǎng)基已準(zhǔn)確配制，整體組成沒有重大錯(cuò)誤。
級(jí)別 2：定性指紋識(shí)別
該級(jí)別指紋識(shí)別包括各種快速且通常定性的方法。
光譜學(xué)，包括紅外 (IR)、拉曼、二維熒光和全反射 X 射線熒光與多變量數(shù)據(jù)分析相結(jié)合，通常被考慮在內(nèi)。由于其較高的成本、復(fù)雜性和環(huán)境影響，色譜技術(shù)目前不常用于指紋識(shí)別。但是，也有使用液相色譜-質(zhì)譜法 (LC-MS)/質(zhì)譜法 (MS) 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)基指紋識(shí)別的案例。隨著技術(shù)的發(fā)展，可以考慮更廣泛地使用色譜方法進(jìn)行 2 級(jí)定性指紋分析。
光譜方法提供有關(guān)物質(zhì)和單個(gè)分析物與電磁輻射相互作用方式的信息。這允許收集化合物或這些化合物的混合物的特定指紋。 IR 是最成熟的方法，其次是拉曼，兩者都表明它們適用于識(shí)別簡(jiǎn)單的化合物。
已經(jīng)開發(fā)出二維熒光并成功應(yīng)用于指紋識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)基。它在復(fù)雜細(xì)胞培養(yǎng)基原材料指紋識(shí)別方面的潛力已在研究中得到證實(shí)，并已應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)基表征。
這些方法都無法檢測(cè)復(fù)雜細(xì)胞培養(yǎng)基樣品中的所有化合物，但它們可以提供有關(guān)化合物的足夠信息以支持穩(wěn)健的表征或 ID 方法。不幸的是，沒有明確的參考文獻(xiàn)庫提供每種方法可以涵蓋的分析物的具體范圍。此處提供的指南支持根據(jù)表征目標(biāo)、材料樣品的特性或可用的專業(yè)知識(shí)來確定最合適的方法。
理論上，拉曼和紅外對(duì)大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)敏感；然而，這些方法僅足夠靈敏、以檢測(cè)培養(yǎng)基中以較高濃度存在的化合物，在大多數(shù)情況下，這些化合物主要是緩沖液和氨基酸。這些方法可能無法檢測(cè)到低水平的維生素或微量元素。
有關(guān)選擇光譜技術(shù)的決策圖表，請(qǐng)參見圖 2。
圖 2：選擇用于指紋識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)基的光譜技術(shù)的決策圖表。
IR 或拉曼光譜可用于對(duì)熒光團(tuán)含量低且重點(diǎn)在于主要化合物的簡(jiǎn)單或復(fù)雜樣品進(jìn)行指紋識(shí)別。拉曼的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以通過包裝進(jìn)行收集，并可用作測(cè)量粉末和液體的手持式儀器。然而，當(dāng)用于粉末表征時(shí)，拉曼光譜對(duì)樣品中存在的各種多晶型物表現(xiàn)出敏感性。與拉曼一樣，IR 也可用于粉末，但對(duì)樣品的水分含量非常敏感，因此在處理吸濕性樣品時(shí)不推薦用于此應(yīng)用。
全反射 X 射線熒光光譜 (TXRF) 可以補(bǔ)充紅外和拉曼光譜。它可以對(duì)已溶解的原材料中存在的痕量金屬進(jìn)行定性分析。
級(jí)別 3：定量測(cè)試
當(dāng)需要更廣泛的指紋識(shí)別或調(diào)查工作時(shí)，幾種方法可能會(huì)有用，包括色譜法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法 (ICP-MS)。以下是對(duì)其中一些技術(shù)的簡(jiǎn)要說明。
元素指紋
ICP-MS 用于按質(zhì)荷比分析樣品中的單個(gè)元素。通常將樣品酸化，然后引入儀器。形成氣溶膠并使用 ICP 形成原子離子，原子離子被移入質(zhì)譜儀，按質(zhì)量分離，然后移至檢測(cè)器。元素通過原子質(zhì)量來識(shí)別，標(biāo)準(zhǔn)曲線用于量化目標(biāo)元素。樣品的質(zhì)譜可以用作與其它樣品的指紋進(jìn)行比較。
TXRF 是一種分析工具，可用于對(duì)溶解的原料中檢測(cè)到的痕量元素進(jìn)行定量分析。將內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中并渦旋，將少量樣品移至玻璃盤上并干燥。樣品分析完成后，使用連接到 TXRF 儀器的專用軟件根據(jù)熒光輻射強(qiáng)度計(jì)算每個(gè)檢測(cè)到的元素的濃度。
除了分析液體樣品外，TXRF 還可以通過樣品的酸消解來分析固體樣品。它允許對(duì)分析樣品中存在的元素進(jìn)行快速、直接的定性和質(zhì)量比評(píng)估，僅微克樣品，不會(huì)因酸消解而發(fā)生化學(xué)變形，顯示其微量分析能力。
色譜法
色譜分離復(fù)雜樣品的成分，并與各種檢測(cè)器一起使用，以識(shí)別和量化可能以低濃度存在的分析物。高效或超高效液相色譜通常以反相模式用于分析水性或水溶性樣品。例如，色譜柱可以是基于反相的、尺寸排阻的、離子交換的或親和的。常見的檢測(cè)器選項(xiàng)包括紫外/可見光 (UV/VIS)、熒光、質(zhì)譜、折射率、電導(dǎo)率和帶電氣溶膠。分析物可以衍生化以實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)檢測(cè)。離子色譜法可用于分析緩沖液和其它工藝液體。
通常，選擇具有適合分析物的色譜柱和檢測(cè)器的系統(tǒng)，開發(fā)方法（色譜柱、流動(dòng)相、柱溫、樣品體積），并生成色譜圖。檢測(cè)峰并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較以量化目標(biāo)分析物。將未知樣品的保留時(shí)間與已知參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，以確認(rèn)樣品的身份。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)基等復(fù)雜樣品，色譜圖還提供了樣品的“指紋”，可以與其它指紋進(jìn)行比較，作為另一種識(shí)別方法。
如果使用 LC-MS，質(zhì)譜會(huì)為指紋添加另一個(gè)維度。圖 3 描述了如何使用多變量數(shù)據(jù)分析將來自多個(gè)檢測(cè)器的方法用于經(jīng)典的目標(biāo)/定量指紋識(shí)別或非目標(biāo)指紋識(shí)別。 UV/VIS 簡(jiǎn)單且便宜，但在復(fù)雜混合物中可能會(huì)受到干擾，因?yàn)樗皇呛軐Ｒ弧?/span>
圖 3：用于細(xì)胞培養(yǎng)基指紋識(shí)別的色譜技術(shù)選擇決策圖。
結(jié)論
盡管細(xì)胞培養(yǎng)基指紋識(shí)別不可能有一種放之四海而皆準(zhǔn)的方法，但這是一種“有一定適用性”的方法。它使培養(yǎng)基制造商/供應(yīng)商和生物制藥最終用戶能夠更深入地了解他們的培養(yǎng)基和產(chǎn)品/工藝能力和要求，并將他們的精力集中在與材料相關(guān)的最重要的事情上。
